抗壞血酸過氧化物酶活性測(cè)定

在茶葉中 實(shí)驗(yàn)原理 APX（抗壞血酸過氧化物酶）催化AsA與H2O2 反應(yīng)而使H2O2:2AsA+ H2O2→2MD-AsA( 單脫氫抗 壞血酸)+2H2O。

抗壞血酸過氧化物酶是以抗壞血 酸為電子供體的，APX首先與H2O2形成中間復(fù)合 物，中間復(fù)合物接著氧化AsA形成產(chǎn)物，當(dāng)AsA未 被復(fù)合物利用時(shí)，APX失活。只要AsA能夠再生， APX就能充分進(jìn)行催化反應(yīng)，從而保護(hù)葉綠體維持 正常的光合能力。 APX酶液的制備 稱取0.5g的茶樹鮮葉剪碎，加入適量 的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴 中充分研磨，離心（10000g、4℃、20min） 取上層清夜1mL，分裝于小離心管中置于 4℃?zhèn)溆没?20℃保存。

APX活性的測(cè)定

提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-磷酸二 氫鉀緩沖液），pH7.8；2mmol/L AsA； 5mmol/L EDTA。 反應(yīng)液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。 在三個(gè)比色皿中各加入20? L鮮葉APX粗酶液， 再加入3mL反應(yīng)液；1號(hào)比色皿中不加AsA和 H2O2啟動(dòng)反應(yīng)；每10s連續(xù)記錄室溫下290nm 吸光值的變化X。室溫下每一分鐘氧化 1? molAsA的酶量作為一個(gè)酶活性單位（U）。

計(jì)算公式

每克鮮葉APX的酶活性U= （X×7.5×1000×60×1000）/ （m×2.8×20×10） 上式中，X：OD值的變化；7.5：每克材料 提取7.5mL粗酶液；1000：將ml轉(zhuǎn)化成?L； 60：將1min轉(zhuǎn)化成60s；1000：將mmol轉(zhuǎn)化 成?mol；m：鮮葉的重量，單位為g；2.8： 吸光系數(shù)mmol/L cm；20：用20?L酶液進(jìn)行 活性測(cè)定；10：每10s記錄吸光值的變化。 測(cè)定茶樹鮮葉APX活性的最佳條件 PVPP的加入量為鮮葉重的1.5倍，提取液 pH為7.8，反應(yīng)液pH為7.0，底物AsA濃度為 0.5mmol/L。

注意事項(xiàng)：

（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降 低來計(jì)算APX活性，因此所加的酶量一般不宜過大 ，應(yīng)使加液量控制在60s內(nèi)，使產(chǎn)生的A290光值下 降呈良好的線性關(guān)系。

（2）由于此反應(yīng)中AsA和H2O2量都很少，可以將 30%的H2O2稀釋500倍，在測(cè)定時(shí)直接吸取15?L的 H2O2與3mL反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動(dòng)反應(yīng)。

（3）H2O2由于本身對(duì)AsA的氧化作用在測(cè)定時(shí)間 內(nèi)可以忽略不計(jì)。

酶制劑相關(guān)產(chǎn)品如下：

因 酶制劑產(chǎn)品眾多，如：過氧化氫酶 粉末、α-葡萄糖苷酶，詳情進(jìn)入酶制劑產(chǎn)品頁